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產品說明：

產品描述：

Calcein Blue, AM本身僅呈微弱熒光(Ex/Em~322/435nm) ,具有細胞膜滲透性。一旦進入細胞后，被細胞內酯酶水解為鈣黃綠素藍(Calcein Blue) , 探針極性增強并能保留在細胞內數小時，此時熒光強度增強且熒光光譜遷移到更長波長(Ex/Em~360/445nm)， 光譜特征類似于DAPI. Hoechst 3342或Hoechst 33258。

使用說明：

一、儲存液制備

儲存液配制范圍可為1 ~ 5 mM,具體根據工作濃度來決定，建議提前配制成1000x儲存液。若使用的工作液為5μM,那么可配制5mM的儲存液，即往1mg CalceinBlue, AM (Mw: 465.41) 內加入430μl細胞培養級別的DMSO  , 充分溶解，混勻。儲存液根據單次用量分裝20°C保存，避免反復凍融，數月穩定(不要超過6個月)。

二、20% Pluronic F-127制備[可選]

稱取100mg Pluronic F-127粉末中加入500μl DMSO,配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40- 50C加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

三、染色步驟

大多數實驗體系中Calcein Blue, AM的工作濃度為2-5μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗,以確定Calcein Blue, AM的最佳工作濃度，以最低的探針濃度得到最好的熒光結果為篩選原則。

1) 取一管適量分裝的儲存液(1000x) 置于室溫，至少回溫20min,低速離心后，用合適的緩沖液如PBS, HBSS-HEPES稀釋到1 x染色工作液。

[注意] :有時可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein Blue, AM儲存液內來增強其水溶性。制備染色工作液前，取一管Calcein Blue, AM儲存液內加入等體積的20% Pluronic F127,使Pluronic F127的終濃度為0.02%。加入Pluronic F127的Calcein Blue, AM溶液不可長期保存，需現配現用。

2) 對于貼壁細胞，先用胰酶EDTA或Accutase消化細胞， 離心收集細胞(1000 rpm, 3min)。對于懸浮細胞，直接離心收集細胞。 [注意] :貼壁細胞也可進行原位染色。

3) 去上清，用PBS (或者其他緩沖液)清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酷酶活性。

4) 用1/10細胞培養基體積的Calcein Blue, AM染色工作液重懸細胞，37℃孵育20min~1h。

[注意] : 1)若細胞自身含有機陰離子轉運體，需加入丙磺舒(1-2.5mM)或者苯磺唑酮(0.1-0.25mM) 到孵育體系內以降低去酷化的Calcein Blue泄露到胞外;2)降低探針加載溫度，可能會減少探針區室化現象。

5) 用PBS (或者其他緩沖液)洗滌細胞兩次去除多余染料。

[注意] :如有必要，使用含有機陰離子轉運抑制劑的緩中液來進行細胞清洗。

6）用含合適濾光片(Ex/Em= 360/445nm) 的儀器進行檢測。

注意事項：

1）熒光染料均存在淬滅問題，請盡星注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）乙酰氧基甲基酯(AM)易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3）Calcein Blue, AM對濕度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。 Calcein Blue, AM儲存液需要分裝避光凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein Blue,AM工作液必須現配現用。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一 次性手套操作。

本產品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。